膜流動性的測定方法主要有熒光探針標記，電子自旋共振以及差示掃描量熱法，x 線衍射，棱碰共振等。...

線粒體膜流動性(fluidity)TMA-DPH熒光檢測試劑盒

 

產品編號：HR0956

產品組成：

保存條件：

2-8℃避光保存。長期-20℃避光。染色液避免反復凍融，需長期保存可分裝后-20℃保存。有效期1年。

【注】：

● 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁，注意需要加熱融解，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴，吸頭也需要放在培養箱預熱，否則容易再次凝固在吸頭鎳幣產生損耗。

線粒體膜流動性(fluidity)TMA-DPH熒光檢測試劑盒產品說明：

膜的流動性是生物膜結構的基本特征之一，主要指膜脂肪酸鏈部分及膜蛋白的運動狀態。膜脂類分子在相變溫度以上條件下主要有側向擴散、旋轉、左右搖擺、伸縮振蕩、翻轉及異化運動等方式。膜蛋白的運動方式大體分為側向及旋轉運動，主要受脂質雙分子層的影響。脂肪酸不飽和鍵含量和鏈的長度明顯影響著膜脂流動性，不飽和鍵的存在會降低膜脂分子間排列的有序性，從而增加膜的流動性，短鏈能減低脂肪酸鏈尾部相互作用，在相變溫度下，不易于凝集，此外，脂肪酸烴鏈圍繞C- C鍵由全反式構型到歪扭(CAUCHE)的旋轉異構運動，也可使流動性加大。

生物膜適宜的流動性是體現生物膜正常功能的必要條件，在一定范圍內，膜流動性增加，有利于膜中酶分子的擴散和旋轉運動，使酶活性增加。一些載體蛋白分子的運動性也取決于膜中脂類分子的流動性。研究發現腫瘤對化療藥物產生的耐藥性主要與細胞膜P 糖蛋白過度表達谷胱甘肽及其相關酶系活性改變有關，也有許多研究表明耐藥細胞膜流動性較親代敏感細胞明顯增加。另有實驗研究發現腹水癌細胞的惡性程度隨著膜流動性的增加而增加，白血病及轉移的腫瘤細胞的膜流動性遠遠高于非轉移細胞。因此，對敏感及耐藥的腫瘤細胞膜流動性的監測有著重要的意義。

膜流動性的測定方法主要有熒光探針標記，電子自旋共振以及差示掃描量熱法，x 線衍射，棱碰共振等。

我司TMA-DPH試劑盒是利用TMA-DPH測定膜流動性的熒光探針法，它在脂蛋白及其類似系統的單分子層動力學研究中特別有用。DPH 及其衍生物（例如TMA-DPH）都呈圓柱形，會發生基于按長分子軸線平行排列而產生發射熒光向偶極躍遷。例如，它們對由于周圍脂類相互作用而導致的再定位非常敏感。它們廣泛地被用于旋轉運動研究中的熒光偏振分析。

TMA-DPH本身不發熒光，當與線粒體膜結合后，熒光大大增強，TMA-DPH與可用的線粒體膜表面成比例，其熒光強度對膜表面積的增加敏感。因此，其熒光強度對于導致膜表面積凈變化的生理過程敏感，使其成為用于監測諸如線粒體體積和膜變化的事件的優異探針。TMA-DPH熒光偏振測量可與視頻顯微鏡組合，以在大脂質體和單線粒體中提供磷脂順序的空間分辨圖像。

TMA-DPH的最大激發波長為355nm，最大發射波長為430nm。

試劑盒以外自備試劑耗材和儀器：

● 含有偏振檢測裝置的設備：熒光分光光度計/酶標儀 ● 離心機 ● 移液器

● PBS ● 或者HBSS ● 熒光檢測專用的黑色96孔板
使用注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否則容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

● 線粒體處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 染色后立即進行分析。

● 標記的條件因細胞種類而異，根據不同樣本的實際染色結果做相應調整，在每次實驗前，請先確定最佳條件。

● 注意線粒體制備的質量。

● 探針的信號變化直接取決于所測量細胞類型的線粒體，建議盡可能使用每孔高的線粒體密度作為起點，并根據需要減少線粒體數量。

● 可以用蛋白定量檢測線粒體數量，通常1g動物組織或5×10⁷細胞的線粒體含量為50μg以上線粒體蛋白。

● 如果需要定量線粒體，稀釋后數分鐘內完成，否則線粒體將分解。

● 盡可能采用高純度的線粒體樣本。

● 最好使用熒光培養專用的透明底黑色培養板。實在沒有的話可以采用透明板，注意孔間隔開，減少檢測時各孔之間的光互相干擾。

● 以下步驟僅供參考。請根據實際實驗方案實際或者參考文獻實驗。

線粒體膜流動性(fluidity)TMA-DPH熒光檢測試劑盒使用方法：

1、染色工作液的配制：

用稀釋液稀釋TMA-DPH 探針1000倍倍，配制成TMA-DPH染色工作液。

【注】：

● 也可以不用試劑盒中的稀釋液，直接用HBSS或PBS稀釋即可。

● 使用前做預實驗在推薦濃度范圍內測試選定最佳濃度。

● 推薦該探針加載濃度在1000-5000倍稀釋，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優化。

2、用染色工作液重懸待測線粒體樣本，在37℃孵育15-45分鐘。

【注】：

● 一般每樣為大于200mg動物組織或1×10⁷細胞的線粒體。

● 線粒體的提取操作對檢測很重要，盡量減少對線粒體的損傷。

3、用pH7.4 HBSS或20mM HEPES或PBS洗滌線粒體1次。

4、用pH7.4 HBSS或20mM HEPES或PBS重懸線粒體。

5、用該線粒體樣本進行檢測。激發波長 355nm，發射波長430nm。

【注】：

● 熒光檢測需要使用熒光專用的透明底黑色培養板。

按下列公式計算熒光偏振度P：

P=（I_VV-GI_VH）/(I_VV+GI_VH)

P值越大，流動性越小；P值越小，流動性越大。

其中校正因子G=I_HV/I_HH

式中：

I_VV:起偏和檢偏器光軸同為垂直方向時測得的熒光強度(I_0°,0°)、(I_//)；

(激發光為垂直方向的偏振光，發射光為垂直方向的偏振光時測得的熒光強度)

I_VH:起偏和檢偏器光軸分別為垂直和水平方向時測得的熒光強度(I_0°,90°)、(I_⊥)；

I_HV:起偏和檢偏器光軸分別為水平和垂直方向時測得的熒光強度(I_90°,0°)；

I_HH:起偏和檢偏器光軸同為水平方向時測得的熒光強度(I_90°,90°)。

微粘度η=2P/(0.46-P)

P值越大，η越高，膜流動性越小；P值越小，η越低，膜流動性越大。

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