本產(chǎn)品提供全套試劑，適用于從各種酵母樣品中提取總核糖體。提取過(guò)程簡(jiǎn)單方便。本試劑盒不能用于冷凍樣品的核糖體提取。...

酵母核糖體提取試劑盒(低速離心法)

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR9084

試劑盒組成：

儲(chǔ)存條件：

2-8℃保存，有效期1年。

【注】：

● 酵母核糖體提取液B、酵母洗滌液D長(zhǎng)期不用時(shí)-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

核糖體是細(xì)胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒(ribonucleoprotein particle)，主要由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成,其惟一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈，所以核糖體是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)器。核糖體無(wú)膜結(jié)構(gòu)，主要由蛋白質(zhì)(40%)和RNA(60%)構(gòu)成.核糖體按沉降系數(shù)分為兩類(lèi)，一類(lèi)(70S)存在于細(xì)菌等原核生物中，另一類(lèi)(80S)存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。他們有的漂浮在細(xì)胞內(nèi)，有的結(jié)集在一起。

本產(chǎn)品提供全套試劑，適用于從各種酵母樣品中提取總核糖體。提取過(guò)程簡(jiǎn)單方便。

本試劑盒不能用于冷凍樣品的核糖體提取。

酵母核糖體提取試劑盒(低速離心法)試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 離心機(jī) ● 振蕩器 ● 勻漿機(jī)/Dounce勻漿器 ● 渦旋混勻器 ● PBS ● 蛋白定量試劑盒

使用注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過(guò)程須保持樣品處于低溫。

● 如果是做核酸類(lèi)下游應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)中所有液體以及器具均應(yīng)該用DEPC處理。用0.1%的DEPC處理12小時(shí)然后高壓。

● 下游用于蛋白質(zhì)類(lèi)實(shí)驗(yàn)的話可以不用DEPC 處理。

● 細(xì)胞最好采用新鮮收集的，或者收集后立即置于-80℃保存的樣本。

● 最好使用標(biāo)準(zhǔn)Dounce勻漿器勻漿，如果沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)Dounce勻漿器，用普通玻璃勻漿器勻漿也可，但是核糖體回收率可能會(huì)下降。

酵母核糖體提取試劑盒(低速離心法)使用方法：

1、酵母培養(yǎng)物，在4℃，1000×g條件下離心5-10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集酵母沉淀。

2、用PBS洗滌酵母兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

【注】：

● 在1000×g離心5分鐘。

3、每100μL體積或100mg濕重酵母沉淀物中加入400μL酵母核糖體提取液A，混勻后，在30℃條件下保溫15分鐘。

【注】：

● 酵母數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整，每次的裂解液用量并不是一定的，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

4、在1000×g條件下離心5-10分鐘，收集酵母沉淀。

5、用300μL酵母洗滌液D重懸細(xì)胞，靜置10分鐘，離心收集酵母。

6、酵母沉淀物中加入500μL酵母核糖體提取液B，充分混勻。

【注】：

● 根據(jù)酵母細(xì)胞量調(diào)整提取液用量，一般加菌體體積的2-5倍均可。

● 按酵母菌體體積每100μL或100mg濕重菌體加入250-500μL提取液。

7、在37℃或室溫條件下輕微振蕩60-90分鐘。

【注】：

● 使用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，提取液能輕微晃動(dòng)即可。

● 沒(méi)有振蕩條件也可以不振蕩，稍微延長(zhǎng)提取液的處理時(shí)間，中間每隔10分鐘用移液器吹打混勻。

● 不同酵母樣本需要的時(shí)間差異較大，根據(jù)下游細(xì)胞裂解的難易程度調(diào)整，如果下游試劑C處理后沉淀沒(méi)有明顯減少，需要延長(zhǎng)此步驟處理時(shí)間。可以延長(zhǎng)至2小時(shí)。

8、在2000×g條件下離心5-10分鐘，棄上清，收集沉淀。

9、沉淀用300μL酵母洗滌液D洗滌兩次。離心收集沉淀。

10、在沉淀中加入400μL酵母核糖體提取液C，充分混勻，用Dounce勻漿器勻漿20-30下。

【注】：

● 標(biāo)準(zhǔn)Dounce勻漿器用緊杵5-8次，松杵勻漿15-20次。

● 勻漿杵一個(gè)上下來(lái)回為一次。

● 普通玻璃勻漿器勻漿一般也不超過(guò)30次，勻漿次數(shù)并非越多越好。

● 如沒(méi)有勻漿器，可在加入試劑C后在振蕩器上振蕩10-30分鐘。用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持提取液有輕微晃動(dòng)即可。沒(méi)有振蕩器的話，在4℃靜置，稍微延長(zhǎng)處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

● 試劑C 處理后沉淀應(yīng)減少，否則振蕩延長(zhǎng)處理時(shí)間。

11、將勻漿液在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。

12、將上清在4℃，3000×g力條件下離心10分鐘，棄沉淀，收集上清。

13、將上清在4℃，12000×g-20000×g力條件下離心10分鐘。棄沉淀，收集上清。

14、在上清中加入100μL試劑E，充分混勻。

15、置2-8℃冰箱靜置過(guò)夜。

【注】：

● 靜置保存時(shí)間不少于10小時(shí)。

16、在4℃條件下，10000×g離心20-45分鐘。

17、小心移除上清，收集沉淀。

【注】：

● 盡可能吸干上清。

● 吸取時(shí)小心，防止吸掉沉淀。

18、沉淀用適量核糖體保存液或其他相應(yīng)的緩沖液重懸。即得到酵母核糖體樣品。

【注】：

● 也可不用盒中的核糖體保存液重懸，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的緩沖液重懸核糖體或直接用于下游實(shí)驗(yàn)。

19、置冰箱備用或直接用于下游實(shí)驗(yàn)。

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