Fluo-3,AM熒光探針采用可見光激發,與傳統的紫外光激發的熒光探針相比,儀器的適用范圍更廣泛,具有更強的探針吸收性能,使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+變化,從而降低了對活細胞的光毒性,檢測敏感度更高。...

鈣離子檢測試劑盒(Fluo-3,AM法,綠色熒光)

 

產品編號：HR9071

產品組成：

儲存條件：

-20℃避光保存，有效期6個月。

【注】：

● 染料長期不用可以-20℃保存，避免反復凍融，可以根據需要小量分裝保存。

● 染色液為DMSO溶液,冬季氣溫較低時為凝固狀態,極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解,變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養箱預熱,否則容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

鈣離子檢測試劑盒(Fluo-3,AM法,綠色熒光)產品簡介：

鈣離子檢測試劑盒采用Fluo-3,AM細胞內鈣離子熒光探針檢測鈣離子濃度水平的變化。

鈣離子濃度變化是活細胞接受外界刺激后產生級聯反應的重要信息傳遞方式,因此細胞內鈣離子檢測是信號轉導G蛋白偶聯受體(GPCR)介導的相關藥物篩選以及其他相關實驗中非常重要的一種研究手段。

Fluo-3,AM具有極高的細胞滲透性,經過簡單孵育即可實現細胞加載。穿透細胞膜進入細胞后被細胞內的酯酶剪切形成不易透過細胞膜的Fluo-3新產物,從而被滯留在細胞內。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的,其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。但是,當它與細胞內鈣離子結合后可以產生較強的熒光,熒光會增加60至100倍,最大激發波長為494nm,最大發射波長為516nm。實際檢測時推薦使用的激發波長為488nm左右,發射波長為515～530nm。可以使用熒光顯微鏡、酶標儀、激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度的變化。

Fluo-3,AM熒光探針采用可見光激發,與傳統的紫外光激發的熒光探針相比,儀器的適用范圍更廣泛,具有更強的探針吸收性能,使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca²⁺變化,從而降低了對活細胞的光毒性,檢測敏感度更高。

檢測方法：

● 流式細胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 激光共聚焦/流式細胞儀/熒光酶標儀/熒光顯微鏡等 ● 離心機 ● HBSS(無酚紅) ● PBS(1×,pH7.4)

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體灑落。

● 探針為了便于觀察防止誤操作導致損失,在試劑盒中時是采用透明管包裝,收到后可以離心轉入干燥黑色避光密封或者用鋁箔包裹避光。

● 熒光染料均存在淬滅問題,請盡量注意避光,以減緩熒光淬滅。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 染色后立即進行分析。

● Fluo-3,AM探針容易受潮,穩定性較差,注意干燥保存。從冰箱取出后,請確認在干燥的環境放至室溫后再開封。

● Fluo-3,AM探針母液時要用干燥的新吸頭,不能使用含水的吸頭。

● 未使用完的Fluo-3,AM探針母液請擰緊螺旋蓋,避免受潮失效。母液遇水極易分解,如果長期不用,建議根據每次使用量分裝保存,用封口膜封口,并用鋁箔紙包裹,放在一個密閉性能好的塑料袋中,并放入一包干燥劑,在≤-20℃密閉避光保存。

● Fluo-3,AM探針工作液含水,配制后不可以長期保存,需現配現用。

● Fluo-3,AM融解后離心至管底部再打開螺旋蓋,防止開蓋時損失。

● 可在染色溶液中加入等體積的20% Pluronic F127溶液(可選步驟),Pluronic F127可以幫助Fluo-3,AM更快進入細胞,不建議在Pluronic F127中長期保存Fluo-3,AM溶液。

● 標記的條件因細胞種類而異,根據不同樣本的實際染色結果做相應調整,在每次實驗前,請先確定最佳條件。在正式試驗前先摸索一下細胞量、鈣離子熒光探針的終濃度、培養時間等,找到最佳實驗條件。以下方法僅供參考。

鈣離子檢測試劑盒(Fluo-3,AM法,綠色熒光)使用方法：

1、染色工作液的配制：

用 HBSS稀釋Fluo-3,AM溶液100倍-1000倍,配制成Fluo-3,AM染色工作液。

【注】：

● 推薦該探針加載濃度在100-1000倍稀釋,具體使用濃度需根據實驗要求進行優化。200倍稀釋適合大部分細胞樣本。

● 為了避免過度加載造成細胞毒性,建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

● 工作液需現配現用,避免反復凍存。

● 不能用含血清的培養基稀釋探針。可以用相應的無血清培養基稀釋探針。

● 貼壁細胞根據下游的檢測方法不同，可以消化收集后染色，也可以在培養器皿上原位染色。

● 原位染色原位檢測的話，需要使用熒光檢測專用的透明底黑色培養板。

2、收集培養好的待測細胞樣本,用HBSS洗滌細胞3次。

【注】：

● 沒有HBSS也可用PBS洗細胞。

● 培養基血清中的酯酶會降解Fluo-3,AM探針,從而降低Fluo-3,AM進入細胞的效果,所以加工作液之前必須充分洗滌細胞,盡量去除培養基的殘留。

3、離心去上清后,將Fluo-3,AM染色工作液加入細胞,在37℃孵育20-60分鐘。

【注】：

● 關于孵育的時間,首次預實驗不能確定,建議先孵育30分鐘。

● 根據熒光效果：如果太強,適當縮短時間；如果熒光強度太弱,適當延長時間。

● 染色工作液加入量以覆蓋細胞即可。

● 如果Fluo-3,AM探針進入細胞的效果不好,可向Fluo-3,AM染液中加入適量20% Pluronic F127溶液,最終稀釋至其終濃度為0.04-0.05%,Pluronic F127可以防止Fluo-3,AM在HBSS中聚合并能幫助其進入細胞。

● Pluronic F127可降低Fluo-3,AM探針的穩定性,因此只能在配制工作液時加入,不能將其加入儲存液長期保存。

4、用HBSS洗滌細胞2-3次。

5、用HBSS重懸細胞。在37℃下再繼續孵育20-40分鐘。

6、然后用該細胞進行熒光鈣離子檢測。激發波長488-495nm,發射波長516nm。

【注】：

● 需要使用熒光檢測專用的透明底黑色培養板。

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