線粒體氧氣消耗檢測試劑盒可以用于直接，實時分析線粒體呼吸和線粒體功能。本試劑盒可以用來測量各種分離的線粒體，分離的酶，細菌，酵母和霉菌等的胞外耗氧情況測量。以96孔細胞培養板計，本試劑盒小包裝可以檢測200個樣本。...

線粒體耗氧率檢測試劑盒

 

產品編號：HR9096

產品組成：

儲存條件：

探針-20℃密封避光保存；試劑B室溫保存，有效期6個月。

【注】：

● 避免反復凍融；注意防止氧化；

產品簡介：

線粒體氧氣消耗檢測試劑盒(Mitochondrial Oxygen Consumption Rate Assay Kit)是利用合成的特異性氧氣熒光探針R02來檢測分離線粒體耗氧情況變化的試劑盒。可以通過簡單的混合基于熒光酶標儀便捷的直接進行耗氧量測定。

耗氧量分析是研究代謝的有用工具。耗氧量測量結果是細胞代謝功能，更具體而言是線粒體功能的關鍵性指示。通過這類指標來探究活細胞代謝，可為細胞功能以及代謝變化在疾病進展中的作用提供深入洞察。

線粒體功能對細胞代謝、存活和能量產生至關重要。線粒體呼吸受損與病理狀態(如癌癥、缺血性再灌注損傷和神經退行性疾病)有關。線粒體毒性也是安全相關的抗藥性和藥物戒斷癥狀的常見原因。

R02耗氧量分析可以實時測量分離線粒體的耗氧量，是以高通量形式來評估用于代謝表征的細胞線粒體呼吸以及評估治療對線粒體功能毒性作用的一種可靠方法。

它可以使用熒光酶標儀在標準微孔板上進行有氧代謝的簡單動力學測定。隨著呼吸作用的進行，溶解氧被消耗，樣品中的氧氣濃度降低，導致R02分析的信號增加，從而實現對耗氧量的測定。

是氧氣敏感的熒光探針，最大激發波長為468nm，最大發射波長為603nm。其熒光通過分子碰撞與氧氣反應，由O₂淬滅，在無氧條件下熒光強度更高，反之有氧條件下熒光強度變低，因此熒光信號的量與樣品中線粒體外O₂的量成反比，從而R02可被用于監測線粒體氧氣消耗的變化。在測定中，耗氧率由熒光信號隨時間的變化計算。線粒體耗氧量增加，熒光信號的變化率增加；反之，耗氧量減少，熒光信號的變化率降低。

R02與O₂的這種反應是非破壞性且完全可逆的，R02對線粒體沒有毒性，其是化學穩定的，惰性的，水溶性的和不滲透的，不能透過完整的線粒體膜。

因此還可以同時與糖酵解， 線粒體膜電位JC-1，ROS和ATP等檢測的試劑結合使用，進行多參數檢測。

用R02進行線粒體耗氧檢測方法及其簡單，不需要適用特殊的儀器設備，只需要熒光酶標儀之類的熒光讀板設備即可。

R02采用可見光激發檢測，相對于采用紫外光激發的檢測試劑，損傷更低，對線粒體的毒害更小。結果更加準確客觀。

線粒體氧氣消耗檢測試劑盒可以用于直接，實時分析線粒體呼吸和線粒體功能。本試劑盒可以用來測量各種分離的線粒體，分離的酶，細菌，酵母和霉菌等的胞外耗氧情況測量。

以96孔細胞培養板計，本試劑盒小包裝可以檢測200個樣本。

線粒體耗氧率檢測試劑盒產品特點：

● 廣泛適用于各種體外模型；不再局限于細胞，還能測定分離的線粒體、分離的酶、微生物和特定的3D培養物；

● 簡單的“混合-檢測”方案允許使用多種其他分析試劑盒進行多參數分析；

● 可逆轉，能夠觀察耗氧量的瞬態和長時間變化；

● 可適配多數熒光酶標儀以及標準96孔和384孔；

● 以高通量的形式方便地測量；

● 無需等待專用設備空閑所需的實驗室時間，也無需大額資金專用設備投入。

產品用途：

● 線粒體功能和細胞代謝研究；

● 測量線粒體活性；

● 研究各種處理對細胞耗氧量的影響；

● 研究基因修飾對細胞耗氧量的影響；

● 研究呼吸和線粒體功能；

● 探究氧含量與細胞代謝變化之間的聯系；

● 直接評估藥物處理的線粒體毒性。

適用樣本類型：

● 分離的線粒體；

● 3D培養物；組織；

● 分離的酶；

● 微生物；細菌/酵母/霉菌。

熒光檢測模式：

● 基礎模式：熒光強度測定；

● 標準模式：時間分辨熒光測量(TR-F)；

● 高級模式：熒光Lifetime calculation(FLIM，Autofluorescence Lifetime Imaging system，Dual-read Ratiometric TR-F measurement)

【注】：

● 以上取決于酶標儀的類型和儀器設置，不是所有儀器可用。

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 熒光酶標儀，須配備相應的波長過濾器和溫度控制器。時間分辨熒光功能的讀板機佳(如果有)。 ● 離心機 ● 移液器 ● PBS緩沖液(1×)或者HBSS(無酚紅)

● 對照試劑(選配，非必須)：Glucose Oxidase，Antimycin A，FCCP

● 黑色透明底熒光專用培養板

注意事項：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 以下操作以96孔板為例。其他培養容器或裝置請根據實際情況調整試劑用量和檢測方法。各試劑等比例調整即可。O₂熒光探針終濃度16倍稀釋最佳。

● 線粒體的提取操作對檢測很重要，盡量減少對線粒體的損傷。

● R02探針的信號變化直接取決于所測量細胞類型的線粒體呼吸速率，建議盡可能使用每孔高的線粒體密度作為起點，并根據需要減少線粒體數量。

● 并非所有線粒體類型都消耗足夠用于檢測的氧氣。

● 最好使用熒光培養專用的透明底黑色培養板。實在沒有的話可以采用透明板，注意孔間隔開，減少檢測時各孔之間的光互相干擾。

● 用于測定的所有儀器試劑溶液耗材均需37℃預熱。

● 添加氧氣封閉液時注意避免產生氣泡。

● 盡可能使用多通道移液器添加試劑。

關于儀器設置：

● 溫度對檢測有較大影響。有條件的話，務必使用配有溫度控制的酶標儀。

● 常規的熒光信號強度測量，使用基于單色儀或基于過濾器的酶標儀，最佳激發波長用450-460nm，發射波長用586-600nm。可根據實際機器和樣本選擇信號最強波長。

● 具有檢測增益參數(PMT，Parameters)的通常設置為中或高。

● TR-F測量可減少非特異性背景和增加探針靈敏度。最佳delay time為約30μs，gate(integration)time 是100μs。

● 一般使用底部讀數bottom read。

關于氧氣封閉液使用：

● 氧氣封閉液可以用移液器吸取添加，添加時需要沿著培養板壁慢慢加入，使其順板壁向下流到培養基表面。

● 也可以直接用滴瓶滴加，倒轉預熱的滴管瓶并輕輕施加壓力，使封閉液足以充注瓶尖。每個孔滴兩滴，使每個液滴在孔側面順應向下流到培養基表面。

● 使用移液器添加封閉液時，可將黃色吸頭的嘴部用鋒利的刀片或剪刀修剪處理。將豎直吸頭離尖端3-4mm處45°角修剪處理。

● 取下滴管瓶內嘴蓋，輕輕吸取預熱的氧氣封閉液。避免上下吹吸形成氣泡。

關于線粒體接種密度：

● 注意所需的線粒體接種密度取決于細胞類型和獲得線粒體的方法。我們推薦進行線粒體接種密度預實驗以確定最佳密度。通常從高線粒體密度(通常為80,000個細胞的線粒體，線粒體提取得率＞80%)開始，每孔的最佳線粒體數一般為：每孔提取80,000個細胞的線粒體(96孔板)。

● 檢測待測樣品都設置3復孔。

● 注意始終在每個96孔板上留出至少6個孔，以免添加線粒體作為空白對照和信號控制孔。

線粒體耗氧率檢測試劑盒關于對照孔設置：

● 一般空白孔要設置，其它對照根據實驗需要決定。

● (推薦對照設置，以下可選，非必須)：

空白對照：

保留兩個或三個孔，使其不添加線粒體以用作空白對照。

向每個孔中添加100μL 新鮮培養基。

(不要在這些孔中添加R02氧熒光探針)

無線粒體陰性對照：

使兩孔或三孔沒有線粒體添加用作無線粒體陰性對照。

加入90μL新鮮培養基+10μL R02氧熒光探針。

無線粒體陽性對照：

使兩孔或三孔沒有線粒體添加用作無線粒體陽性對照。

加入90μL新鮮培養基+10μL(1mg/mL)葡萄糖氧化酶(水溶液)+10μL R02氧熒光探針試劑。

如果讀板器設置正確，則這些孔將顯示出熒光強度/壽命的快速增加，這表明葡萄糖氧化酶活性引起的耗氧。

有線粒體陰性對照：

向包含線粒體的兩個或三個孔中加入1μL(100μM)抗霉素A儲備溶液+10μL R02氧熒光探針試劑。

抑制劑抗霉素A將抑制由線粒體呼吸引起的氧氣消耗。

有線粒體陽性對照：

向包含線粒體的兩個或三個孔中加入1μL(0.1-5mM)FCCP儲備溶液+10μL R02氧熒光探針試劑。激活劑FCCP將顯著提高線粒體呼吸的氧氣消耗。

【注】：

● 如果使用FCCP處理，必須進行劑量測試，因為線粒體對FCCP呈現鐘形響應。

使用方法：

1. 準備線粒體模型。

【注】：

● 根據自己實驗需要設計相應方案，準備待測試化合物。

● 注意設置對照孔，復孔等。

● 建議始終使用至少兩個沒有線粒體的孔作為空白對照孔(不要在這些孔中添加R02氧熒光探針)和至少兩個其他無線粒體的孔作為無線粒體陰性對照孔。還可以考慮設置無線粒體陽性對照，如前“推薦對照”中所述。

● 線粒體的提取操作對檢測很重要，盡量減少對線粒體的損傷。

2. 提取待檢測線粒體，用PBS洗滌線粒體。

3. 加入100μL線粒體HBSS懸液。

【注】：

● 以96孔板為例。

4. 加入10μL R02氧熒光探針，充分混勻。

5. (選做)可以在此處添加待測試化合物(通常為1-10μL)(如果需要的話)。

【注】：

● 建議將添加的化合物的量保持在較低水平，以最大程度地減少溶劑的潛在影響。

6. 每孔加入100μL氧氣封閉液。

【注】：

● 建議用移液器準確吸取，也可以直接用滴瓶滴加2滴。

● 需要沿著培養板壁慢慢加入，不要伸到培養基液面下快速加入。

● 注意避免產生氣泡。

● 封閉液量的微小變化(在90-110μL之間)對檢測沒有不利影響。

7. 然后用該96孔板進行熒光線粒體外O₂消耗變化情況檢測。

激發波長468nm，發射波長603nm。每2分鐘或3分鐘讀取一次。

【注】：

● 熒光強度隨著線粒體外O₂消耗增加。

● 熒光檢測需要使用熒光專用的透明底黑色培養板。

● 最好用帶時間分辨熒光功能的讀板機。

8. 繪制耗氧率曲線。

【注】：

● 熒光強度值經空白對照校正。

9. 計算每個樣品的斜率值。

【注】：

● 注意選擇每個信號曲線的線性部分，避開起始的滯后數據，避開后期的平穩期。

● 線性回歸確定每孔的斜率(OCR耗氧率)。

● 計算重復孔之間的平均值。

● (選做)如果需要，可以從所有測試值中減去無線粒體陰性對照樣品或基于線粒體的陰性對照樣品獲得的斜率。

結果示例：

1. 斜率曲線獲得

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. 繪制劑量反應曲線

要生成劑量響應曲線，繪制計算的耗氧率(OCR)與生成如上OCR曲線的數據對應的化合物濃度的關系曲線，

如下：OCR與藥物濃度的關系證明抗霉素A引起對線粒體呼吸的抑制反應。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

常見問題分析：

● 耗氧率檢測趨勢跟預期的不一致？

檢查線粒體接種和移液的一致性。

增加線粒體密度。

將測定體積減少到60微升。

在某些較短的檢測時間區間內，會出現熒光數據的波動情況，出現斜率下降或不變化，需要擴大到更長的時間范圍內來分析耗氧率趨勢。一般檢測時間范圍不少于30分鐘。

溫度對檢測有較大影響。有條件的話，務必使用配有溫度控制的酶標儀，儀器以及所有培養基和儲備溶液均須使用前37℃預熱。注意某些讀板器的溫度控制不一致，如果存在這種情況，請考慮將測定和平衡溫度降低到30℃，避開外圈。

● 使用的線粒體類型靈敏度不夠？

可以考慮以下改善方案：

增加酶標儀的增益(PMT)設置。

在無酚紅或無血清的情況下測定。

增加R02氧熒光探針的體積(15μL/孔)。

增加線粒體密度。

將測定體積減少到60微升。

測量底部讀數(如果有)。

調整TR-F焦距。

● 我無法在含有線粒體的孔中檢測到任何信號，或者我可以檢測到信號，但斜率(速率)顯得很低？

檢查正確的儀器設置，設置信號優化。

增加線粒體密度。

將測定體積減少到60微升。

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